枳殼為蕓香科柑橘屬植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，性微寒，味苦、辛、酸，歸脾、胃經(jīng)；具有理氣寬中、行滯消脹的功效[1]，其主產(chǎn)于江西、四川、湖南、湖北、貴州等地[2]，以江西枳殼的質(zhì)量為最佳，是江西省四大“道地藥材”之一[3]。枳殼的化學(xué)成分主要有黃酮類、揮發(fā)油類、香豆素類、生物堿類、多糖、三萜和其他微量成分[4-5]。枳殼的炮制方法有麩炒、酒炒、醋炒、蜜水炒等，目前《中國(guó)藥典》2020年版只收載枳殼、麩炒枳殼。枳殼生用辛燥作用較強(qiáng)，偏于行氣寬中除脹；經(jīng)麩炒后可緩和其峻烈之性，偏于理氣健胃消食。枳殼經(jīng)麩炒后，臨床應(yīng)用發(fā)生了改變，可見，對(duì)中藥飲片不同炮制品的準(zhǔn)確區(qū)分對(duì)臨床科學(xué)合理用藥至關(guān)重要[6]。
氣味是傳統(tǒng)中藥經(jīng)驗(yàn)鑒別的重要特征之一，枳殼經(jīng)麩炒后，氣味由“清香”轉(zhuǎn)向“略有焦香氣”，但此描述較為主觀、模糊。隨著仿生技術(shù)的不斷發(fā)展，電子鼻技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品[7-8]、農(nóng)業(yè)[9]、醫(yī)藥[10-12]、環(huán)境科學(xué)[13]等領(lǐng)域。Heracles NEO超快速氣相電子鼻技術(shù)基于頂空氣相原理，具有使用壽命長(zhǎng)、信號(hào)穩(wěn)定、重復(fù)性好、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[6]。
本研究基于Heracles NEO超快速氣相電子鼻技術(shù)結(jié)合Arochembase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，采用氣味指紋圖譜、多變量統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)枳殼麩炒前后氣味差異標(biāo)志物進(jìn)行快速識(shí)別，以期從氣味上快速鑒別生、麩炒枳殼飲片，為生、麩炒枳殼飲片的質(zhì)量控制提供參考。
1 儀器與材料
1.1 儀器
Heracles NEO型超快速氣相電子鼻、PAL RSI型全自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、MXT-5非極性毛細(xì)管柱、MXT-1701中極性毛細(xì)管柱，法國(guó)Alpha MOS公司；GA-380N型低噪音空氣泵，北京中興匯利科技發(fā)展有限公司；GH-380N型高純氫氣發(fā)生器，北京中興匯利科技發(fā)展有限公司；FA1104N型電子分析天平，上海菁海儀器有限公司；BO-400Y型多功能粉碎機(jī)，中國(guó)永康鉑歐五金廠。
1.2 材料
12批枳殼樣品購(gòu)于甘肅中天藥業(yè)有限責(zé)任公司，具體樣品批次信息見表1，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定，確定樣品來源為蕓香科植物酸橙C. aurantium L.的干燥未成熟果實(shí)。
正構(gòu)烷烴nC6～nC16混合對(duì)照品，美國(guó)Restek公司，批號(hào)A10142930；α-蒎烯對(duì)照品，批號(hào)110897-202204，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.4%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院；D-檸檬烯對(duì)照品（CAS號(hào)7705-14-8，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%）、β-月桂烯對(duì)照品（CAS號(hào)123-35-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥90%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。
2 方法與結(jié)果
2.1 生、麩炒枳殼的炮制
將12批枳殼藥材，按照《中國(guó)藥典》2020年版一部枳殼項(xiàng)下收載的枳殼、麩炒枳殼飲片炮制方法，分別對(duì)應(yīng)炮制成生枳殼飲片12批（編號(hào)R1～R12）、麩炒枳殼飲片12批（編號(hào)F1～F12），供實(shí)驗(yàn)研究用。
2.2 對(duì)照品溶液的制備
分別精密量取D-檸檬烯對(duì)照品、α-蒎烯對(duì)照品、β-月桂烯對(duì)照品各1 μL，置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，分別精密加入20 μL正構(gòu)烷烴nC6～nC16混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，密封，即得對(duì)照品溶液。
2.3 供試品溶液的制備
取各批次生、麩炒枳殼樣品，經(jīng)打粉后過二號(hào)篩，密封冷藏備用。分析時(shí)，稱取樣品粉末1.0 g至20 mL頂空瓶中，以鋁制硅膠墊的頂空瓶蓋進(jìn)行鉗口密封，備用。
2.4 生、麩炒枳殼氣味檢測(cè)方法的建立
為獲得良好的分離分析效果，需要對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，尋找最佳檢測(cè)條件。選取編號(hào)為F12供試品粉末作為樣品，對(duì)孵化溫度、孵化時(shí)間、樣品用量、進(jìn)樣量等關(guān)鍵影響因素進(jìn)行單因素考察。
2.4.1 孵化溫度考察 精密稱定F12樣品0.5 g，在孵化時(shí)間20 min，進(jìn)樣量3000 μL的條件下，考察孵化溫度60、65、70、75、80 ℃，每個(gè)水平平行測(cè)定3次。對(duì)所得色譜圖信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在75 ℃時(shí)，所得色譜峰的信息較豐富，且各色譜峰峰形良好、穩(wěn)定。因此，選擇孵化溫度為75 ℃。在孵化溫度從60 ℃升至80 ℃的過程中，50～60 s處色譜峰增高較為明顯，孵化溫度為75 ℃時(shí)，平均增幅高于20%。
2.4.2 孵化時(shí)間考察 精密稱定F12樣品0.5 g，在孵化溫度75 ℃，進(jìn)樣量3000 μL的條件下，考察孵化時(shí)間5、10、15、20、25 min，每個(gè)水平平行測(cè)定3次。對(duì)所得色譜圖信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著孵化時(shí)間的延長(zhǎng)，色譜峰的峰面積逐漸增大。當(dāng)孵化時(shí)間達(dá)到10 min時(shí)，各色譜峰趨于飽和穩(wěn)定，因此選擇孵化時(shí)間為10 min。在孵化時(shí)間從5 min增加到25 min的過程中，當(dāng)孵化時(shí)間為10 min及更長(zhǎng)時(shí)，在50～60 s處色譜峰峰面積增幅均高達(dá)500%。
2.4.3 樣品用量考察 在孵化溫度75 ℃，孵化時(shí)間10 min，進(jìn)樣量3000 μL的條件下，考察樣品用量0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 g，每個(gè)水平平行測(cè)定3次。結(jié)果分析表明，當(dāng)樣品用量為1.0 g時(shí)，所得色譜圖信息良好，因此，選擇樣品用量為1.0 g。
2.4.4 進(jìn)樣量考察 精密稱定F12樣品1.0 g，在孵化溫度75 ℃，孵化時(shí)間10 min的條件下，考察進(jìn)樣量1000、2000、3000、4000、5000 μL，每個(gè)水平平行測(cè)定3次。對(duì)所得色譜圖信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到4000 μL后，色譜峰穩(wěn)定，表明其氣味基本趨于飽和，因此，選擇進(jìn)樣量為4000 μL。
2.4.5 檢測(cè)條件的確定 通過單因素實(shí)驗(yàn)的考察，確定生、麩炒枳殼的Heracles NEO檢測(cè)條件為：樣品瓶20 mL；稱樣量1.0 g；孵化溫度75 ℃，孵化時(shí)間10 min，孵化爐轉(zhuǎn)速500 r/min，捕集阱初始溫度40 ℃，捕集阱最終溫度250 ℃，捕集阱分流速率10 mL/min，捕集持續(xù)時(shí)間26 s，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測(cè)器溫度260 ℃；進(jìn)樣量4000 μL，進(jìn)樣體積流量125 μL/s，進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間21 s，柱溫的初始溫度50 ℃，柱溫程序升溫方式4.0 ℃/s至90 ℃、1.0 ℃/s至160 ℃、0.2 ℃/s至165 ℃，保持5 s、2.0 ℃/s至225 ℃、4.0 ℃/s至250 ℃，保持30 s；采集時(shí)間150 s；FID增益12。
2.5 方法學(xué)考察
2.5.1 精密度試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備1批供試品粉末，分別裝于6個(gè)電子鼻專用頂空進(jìn)樣瓶中，每份稱取1.0 g，精密稱定，用隔墊密封，放置在自動(dòng)進(jìn)樣器上，進(jìn)樣分析。結(jié)果（表2）表明，11個(gè)色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD最大值分別為0.38%、4.4%，表明儀器精密度良好。
2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6批供試品粉末，裝于6個(gè)進(jìn)樣瓶中，每份稱取1.0 g，精密稱定，進(jìn)樣分析。結(jié)果（表2）表明，11個(gè)色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD最大值分別為0.35%、4.7%，表明方法重復(fù)性較好。
2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備1批供試品粉末，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析。結(jié)果（表2）表明，11個(gè)色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD最大值分別為0.44%、4.9%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.6 超快速氣相電子鼻檢測(cè)結(jié)果分析
按“2.4.5”項(xiàng)下的檢測(cè)條件對(duì)生、麩炒枳殼飲片各批次樣品進(jìn)行分析，建立氣味指紋圖譜。將校正混合物正構(gòu)烷烴nC6～nC16及對(duì)照品置頂空瓶中，以與樣品相同的孵育和分析條件進(jìn)行分析，將生、麩炒枳殼飲片色譜峰的保留時(shí)間轉(zhuǎn)化為Kovats保留指數(shù)，參照AroChembase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析[6,14]，比較生、麩炒枳殼飲片氣味成分變化。以Alpha Soft 17.0（法國(guó)Toulouse公司）軟件對(duì)各樣品氣味指紋圖譜進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，比較各樣品差異，尋找差異性氣味標(biāo)志化合物。
2.6.1 氣味指紋圖譜的建立 基于Heracles NEO超快速氣相電子鼻檢測(cè)分析結(jié)果，以MXT-5色譜柱采集的信號(hào)建立生、麩炒枳殼飲片樣品氣味指紋圖譜，結(jié)果如圖1、2所示。
將生枳殼飲片和麩炒枳殼飲片氣味指紋圖譜共有模式（由于色譜峰主要集中在前90 s內(nèi)，故選擇前90 s的色譜圖）作鏡像圖，比較兩者色譜峰的數(shù)目及峰面積變化規(guī)律，尋找專屬性差異，可直觀觀察炮制前后的氣味量比關(guān)系變化情況，結(jié)果見圖3。由圖譜可知，在前10～30 s內(nèi)，麩炒枳殼相比于生枳殼，色譜峰數(shù)目有增加，例如4、6號(hào)峰；在50～70 s內(nèi)，麩炒枳殼相比于生枳殼，色譜峰數(shù)目幾乎無變化，但色譜峰的峰高下降明顯，例如8～10號(hào)峰；經(jīng)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，12批麩炒枳殼飲片中8號(hào)峰（β-月桂烯）峰高平均下降54.5%、9號(hào)峰（D-檸檬烯）平均下降42.4%，10號(hào)峰（γ-松油烯）平均下降46.1%，表明枳殼經(jīng)麩炒后揮發(fā)性成分含量下降明顯。與文獻(xiàn)“經(jīng)麩炒后，麥麩皮可以吸收部分揮發(fā)油，使揮發(fā)油成分降低”論述相一致[15]。
2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） PCA是一種無監(jiān)督的模式識(shí)別方法，將數(shù)據(jù)降維處理提取幾個(gè)特征值較大且能反映樣本信息變量的因子進(jìn)行線性分類，可在多維空間直觀顯示樣品間的差異，同時(shí)也可顯示變量之間的分布[11,16]。將超快速氣相電子鼻所分離色譜峰作為影響因子，進(jìn)行PCA，結(jié)果見圖4。在PCA模型中，第1主成分（PC1）貢獻(xiàn)率為99.504%，第2主成分（PC2）貢獻(xiàn)率為0.196%，第3主成分（PC3）貢獻(xiàn)率為0.185 7%，主成分累積貢獻(xiàn)率之和達(dá)99.885 7%，能較好地對(duì)生、麩炒枳殼飲片進(jìn)行區(qū)分。
2.6.3 判別因子分析（discriminant factor analysis，DFA） DFA是在主成分分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)某些準(zhǔn)則建立判別函數(shù)，將不同組別樣本的差異擴(kuò)大，使同類樣本間差異縮小的一種具有判別分類功能的數(shù)據(jù)模型，可以用來識(shí)別和分類未知樣本[11,17]。對(duì)生、麩炒枳殼樣品的超快速氣相電子鼻數(shù)據(jù)進(jìn)行判別因子分析，結(jié)果如圖5所示，橫、縱坐標(biāo)分別表示DFA轉(zhuǎn)換得到的第1區(qū)分指數(shù)（DF1）和第2區(qū)分指數(shù)（DF2）。圖中DF1的區(qū)分指數(shù)為100%，說明DFA分析法能夠更好地從氣味角度區(qū)分生、麩炒枳殼樣品，且二者距離較遠(yuǎn)，氣味明顯改變，差異較大，這也符合實(shí)際感官描述。表明氣相電子鼻可以快速鑒別生、麩炒枳殼飲片，進(jìn)一步驗(yàn)證了PCA的分析結(jié)果。
2.6.4 生、麩炒枳殼飲片氣味差異標(biāo)志物分析 將生、麩炒枳殼飲片在超快速氣相電子鼻色譜柱上采集到的色譜峰與Arochembase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配分析，結(jié)果共鑒定出11個(gè)主要?dú)馕痘瘜W(xué)成分，其中生枳殼飲片中有9個(gè)氣味化學(xué)成分，與麩炒枳殼相比，缺少甲基叔丁基醚、異戊醇2個(gè)成分。生、麩炒枳殼中可能存在的化合物及感官描述信息見表3。進(jìn)一步分析已鑒定出的可能化合物氣味信息發(fā)現(xiàn)，β-月桂烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、4-異丙烯基甲苯、2-壬基醇具有“桔子、橙、檸檬”的味道，而桔子、橙、檸檬均為蕓香科柑橘屬植物，果皮均含有豐富的揮發(fā)油，β-月桂烯、D-檸檬烯和γ-松油烯為單萜類化合物，是揮發(fā)油的組成成分，具有特殊香氣，且D-檸檬烯主要存在于柑橘類植物中[18]；本研究用枳殼飲片來源于蕓香科柑橘屬植物，表明已鑒定出的成分與枳殼含有的成分有較好的一致性。
在得到生、麩炒枳殼飲片氣味成分信息的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步分析得出氣味差異標(biāo)志物，以11個(gè)氣味成分所對(duì)應(yīng)的色譜峰峰面積為變量，采用SIMCA 14.1軟件建立生、麩炒枳殼OPLS-DA模型，分析得到11個(gè)成分的VIP值，結(jié)果見圖6。VIP值越大，表明該成分對(duì)區(qū)分生、麩炒枳殼飲片的貢獻(xiàn)越大。由圖6可知，對(duì)區(qū)分生、麩炒枳殼飲片貢獻(xiàn)較大的前3個(gè)成分是D-檸檬烯、β-月桂烯和γ-松油烯，且這3個(gè)成分也是多數(shù)學(xué)者研究[19-20]有報(bào)道的枳殼揮發(fā)油組成成分，結(jié)合枳殼麩炒前后揮發(fā)性成分含量變化情況，初步推測(cè)這3個(gè)成分為區(qū)分生、麩炒枳殼飲片的氣味差異標(biāo)志物。
3 討論
中藥飲片經(jīng)炮制后，其色、氣、味多會(huì)發(fā)生改變，真?zhèn)蝺?yōu)劣的判斷多依靠老藥工的經(jīng)驗(yàn)來判斷，具有主觀性強(qiáng)、傳承難度大的缺點(diǎn)[21]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前電子眼、電子鼻、電子舌等新型仿生感官技術(shù)已逐步應(yīng)用于中藥飲片質(zhì)量控制方面，將傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別進(jìn)行了客觀化表達(dá)。
枳殼為蕓香科柑橘屬植物的未成熟果實(shí)，眾所周知，蕓香科柑橘屬植物所結(jié)果實(shí)的果皮中含有揮發(fā)油，大多數(shù)具有清香的氣味，且枳殼經(jīng)麩炒后氣味發(fā)生變化，轉(zhuǎn)變?yōu)?ldquo;略有焦香氣”。本研究基于Heracles NEO超快速氣相電子鼻建立了生、麩炒枳殼飲片氣味快速檢測(cè)方法，測(cè)定了生、麩炒枳殼飲片氣味指紋圖譜，指認(rèn)了11個(gè)氣味化學(xué)成分，其中甲基叔丁基醚和異戊醇為麩炒枳殼飲片中新增加成分；結(jié)合OPLS-DA模型中的VIP值及成分變化情況，推測(cè)D-檸檬烯、β-月桂烯和γ-松油烯為生、麩炒枳殼氣味差異標(biāo)志物。
枳殼經(jīng)麩炒后，其燥性得到緩和，偏于理氣健胃消食，生熟異治，更好地滿足臨床治療需求。揮發(fā)油是枳殼“寬中除脹”的主要活性成分，枳殼經(jīng)麩炒后，對(duì)胃腸道的刺激作用減弱，其含有的成分對(duì)胃排空、腸蠕動(dòng)具有明顯的促進(jìn)作用，能抑制胃腸平滑肌收縮[22-23]，還具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[20,24-27]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)麩炒的過程中輔料麥麩能與共炒的飲片發(fā)生化學(xué)變化[28]，存在相互吸附作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，枳殼經(jīng)麩炒后有成分的新增，已初步鑒定出的甲基叔丁基醚和異戊醇推測(cè)可能是麥麩與枳殼在高溫炒制過程中發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的新成分，也有可能是麥麩中的揮發(fā)性成分吸附至枳殼。枳殼和麥麩在炒制過程中揮發(fā)性成分的組成及含量變化是麩炒枳殼性味及功效發(fā)生變化的基礎(chǔ)，還需要進(jìn)一步深入研究麩炒過程中成分變化的規(guī)律，同時(shí)結(jié)合藥效學(xué)研究，闡明研究麩炒枳殼的炮制機(jī)理。
與傳統(tǒng)GC-MS聯(lián)用技術(shù)方法相比，超快速氣相電子鼻采用雙色譜柱同時(shí)進(jìn)樣分析，通過Kovats保留指數(shù)對(duì)氣味成分進(jìn)行定性分析，具有分析時(shí)間短、靈敏度高、樣品用量少、無需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)。但基于其檢測(cè)原理，儀器使用時(shí)對(duì)環(huán)境要求較高，使用過程中要保證環(huán)境的穩(wěn)定；且匹配數(shù)據(jù)庫(kù)AroChembase也具有一定局限性，國(guó)外在研發(fā)儀器時(shí)多是針對(duì)某一類物質(zhì)如烴類、醇類[30]，定性分析出來的氣味成分專屬性、特征性較弱，難以滿足氣味復(fù)雜的中藥的需求。但超快速電子鼻作為新興現(xiàn)代仿生技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)中藥飲片的快速檢測(cè)，有望應(yīng)用于中藥飲片生產(chǎn)過程的在線檢測(cè)，可極大促進(jìn)中藥飲片產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
本研究中生、麩炒枳殼鑒別出的氣味成分?jǐn)?shù)量有限，后續(xù)研究可結(jié)合GC-MS、HS-SPME-GC-MS等多種檢測(cè)手段，從定性定量角度更加全面分析枳殼麩炒前后各類成分變化情況，以期為研究枳殼麩炒機(jī)理及枳殼飲片生產(chǎn)質(zhì)量在線監(jiān)測(cè)提供參考。
來 源：中草藥雜志社
參考文獻(xiàn)：梅 茜，許金國(guó)，蘇聯(lián)麟，毛春芹，陸兔林，房 方．基于Heracles NEO超快速氣相電子鼻對(duì)枳殼麩炒前后氣味差異標(biāo)志物的快速識(shí)別研究 [J]. 中草藥, 2023, 54(16):5165-5171.
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氣味是傳統(tǒng)中藥經(jīng)驗(yàn)鑒別的重要特征之一，枳殼經(jīng)麩炒后，氣味由“清香”轉(zhuǎn)向“略有焦香氣”，但此描述較為主觀、模糊。隨著仿生技術(shù)的不斷發(fā)展，電子鼻技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品[7-8]、農(nóng)業(yè)[9]、醫(yī)藥[10-12]、環(huán)境科學(xué)[13]等領(lǐng)域。Heracles NEO超快速氣相電子鼻技術(shù)基于頂空氣相原理，具有使用壽命長(zhǎng)、信號(hào)穩(wěn)定、重復(fù)性好、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[6]。
本研究基于Heracles NEO超快速氣相電子鼻技術(shù)結(jié)合Arochembase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，采用氣味指紋圖譜、多變量統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)枳殼麩炒前后氣味差異標(biāo)志物進(jìn)行快速識(shí)別，以期從氣味上快速鑒別生、麩炒枳殼飲片，為生、麩炒枳殼飲片的質(zhì)量控制提供參考。
1 儀器與材料
1.1 儀器
Heracles NEO型超快速氣相電子鼻、PAL RSI型全自動(dòng)頂空進(jìn)樣器、MXT-5非極性毛細(xì)管柱、MXT-1701中極性毛細(xì)管柱，法國(guó)Alpha MOS公司；GA-380N型低噪音空氣泵，北京中興匯利科技發(fā)展有限公司；GH-380N型高純氫氣發(fā)生器，北京中興匯利科技發(fā)展有限公司；FA1104N型電子分析天平，上海菁海儀器有限公司；BO-400Y型多功能粉碎機(jī)，中國(guó)永康鉑歐五金廠。
1.2 材料
12批枳殼樣品購(gòu)于甘肅中天藥業(yè)有限責(zé)任公司，具體樣品批次信息見表1，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳建偉教授鑒定，確定樣品來源為蕓香科植物酸橙C. aurantium L.的干燥未成熟果實(shí)。
2 方法與結(jié)果
2.1 生、麩炒枳殼的炮制
將12批枳殼藥材，按照《中國(guó)藥典》2020年版一部枳殼項(xiàng)下收載的枳殼、麩炒枳殼飲片炮制方法，分別對(duì)應(yīng)炮制成生枳殼飲片12批（編號(hào)R1～R12）、麩炒枳殼飲片12批（編號(hào)F1～F12），供實(shí)驗(yàn)研究用。
2.2 對(duì)照品溶液的制備
分別精密量取D-檸檬烯對(duì)照品、α-蒎烯對(duì)照品、β-月桂烯對(duì)照品各1 μL，置20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，分別精密加入20 μL正構(gòu)烷烴nC6～nC16混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，密封，即得對(duì)照品溶液。
2.3 供試品溶液的制備
取各批次生、麩炒枳殼樣品，經(jīng)打粉后過二號(hào)篩，密封冷藏備用。分析時(shí)，稱取樣品粉末1.0 g至20 mL頂空瓶中，以鋁制硅膠墊的頂空瓶蓋進(jìn)行鉗口密封，備用。
2.4 生、麩炒枳殼氣味檢測(cè)方法的建立
為獲得良好的分離分析效果，需要對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，尋找最佳檢測(cè)條件。選取編號(hào)為F12供試品粉末作為樣品，對(duì)孵化溫度、孵化時(shí)間、樣品用量、進(jìn)樣量等關(guān)鍵影響因素進(jìn)行單因素考察。
2.4.1 孵化溫度考察 精密稱定F12樣品0.5 g，在孵化時(shí)間20 min，進(jìn)樣量3000 μL的條件下，考察孵化溫度60、65、70、75、80 ℃，每個(gè)水平平行測(cè)定3次。對(duì)所得色譜圖信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在75 ℃時(shí)，所得色譜峰的信息較豐富，且各色譜峰峰形良好、穩(wěn)定。因此，選擇孵化溫度為75 ℃。在孵化溫度從60 ℃升至80 ℃的過程中，50～60 s處色譜峰增高較為明顯，孵化溫度為75 ℃時(shí)，平均增幅高于20%。
2.4.2 孵化時(shí)間考察 精密稱定F12樣品0.5 g，在孵化溫度75 ℃，進(jìn)樣量3000 μL的條件下，考察孵化時(shí)間5、10、15、20、25 min，每個(gè)水平平行測(cè)定3次。對(duì)所得色譜圖信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著孵化時(shí)間的延長(zhǎng)，色譜峰的峰面積逐漸增大。當(dāng)孵化時(shí)間達(dá)到10 min時(shí)，各色譜峰趨于飽和穩(wěn)定，因此選擇孵化時(shí)間為10 min。在孵化時(shí)間從5 min增加到25 min的過程中，當(dāng)孵化時(shí)間為10 min及更長(zhǎng)時(shí)，在50～60 s處色譜峰峰面積增幅均高達(dá)500%。
2.4.3 樣品用量考察 在孵化溫度75 ℃，孵化時(shí)間10 min，進(jìn)樣量3000 μL的條件下，考察樣品用量0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 g，每個(gè)水平平行測(cè)定3次。結(jié)果分析表明，當(dāng)樣品用量為1.0 g時(shí)，所得色譜圖信息良好，因此，選擇樣品用量為1.0 g。
2.4.4 進(jìn)樣量考察 精密稱定F12樣品1.0 g，在孵化溫度75 ℃，孵化時(shí)間10 min的條件下，考察進(jìn)樣量1000、2000、3000、4000、5000 μL，每個(gè)水平平行測(cè)定3次。對(duì)所得色譜圖信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到4000 μL后，色譜峰穩(wěn)定，表明其氣味基本趨于飽和，因此，選擇進(jìn)樣量為4000 μL。
2.4.5 檢測(cè)條件的確定 通過單因素實(shí)驗(yàn)的考察，確定生、麩炒枳殼的Heracles NEO檢測(cè)條件為：樣品瓶20 mL；稱樣量1.0 g；孵化溫度75 ℃，孵化時(shí)間10 min，孵化爐轉(zhuǎn)速500 r/min，捕集阱初始溫度40 ℃，捕集阱最終溫度250 ℃，捕集阱分流速率10 mL/min，捕集持續(xù)時(shí)間26 s，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測(cè)器溫度260 ℃；進(jìn)樣量4000 μL，進(jìn)樣體積流量125 μL/s，進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間21 s，柱溫的初始溫度50 ℃，柱溫程序升溫方式4.0 ℃/s至90 ℃、1.0 ℃/s至160 ℃、0.2 ℃/s至165 ℃，保持5 s、2.0 ℃/s至225 ℃、4.0 ℃/s至250 ℃，保持30 s；采集時(shí)間150 s；FID增益12。
2.5 方法學(xué)考察
2.5.1 精密度試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備1批供試品粉末，分別裝于6個(gè)電子鼻專用頂空進(jìn)樣瓶中，每份稱取1.0 g，精密稱定，用隔墊密封，放置在自動(dòng)進(jìn)樣器上，進(jìn)樣分析。結(jié)果（表2）表明，11個(gè)色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD最大值分別為0.38%、4.4%，表明儀器精密度良好。
2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備1批供試品粉末，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析。結(jié)果（表2）表明，11個(gè)色譜峰的保留時(shí)間和峰面積的RSD最大值分別為0.44%、4.9%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.6 超快速氣相電子鼻檢測(cè)結(jié)果分析
按“2.4.5”項(xiàng)下的檢測(cè)條件對(duì)生、麩炒枳殼飲片各批次樣品進(jìn)行分析，建立氣味指紋圖譜。將校正混合物正構(gòu)烷烴nC6～nC16及對(duì)照品置頂空瓶中，以與樣品相同的孵育和分析條件進(jìn)行分析，將生、麩炒枳殼飲片色譜峰的保留時(shí)間轉(zhuǎn)化為Kovats保留指數(shù)，參照AroChembase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析[6,14]，比較生、麩炒枳殼飲片氣味成分變化。以Alpha Soft 17.0（法國(guó)Toulouse公司）軟件對(duì)各樣品氣味指紋圖譜進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，比較各樣品差異，尋找差異性氣味標(biāo)志化合物。
2.6.1 氣味指紋圖譜的建立 基于Heracles NEO超快速氣相電子鼻檢測(cè)分析結(jié)果，以MXT-5色譜柱采集的信號(hào)建立生、麩炒枳殼飲片樣品氣味指紋圖譜，結(jié)果如圖1、2所示。
中藥飲片經(jīng)炮制后，其色、氣、味多會(huì)發(fā)生改變，真?zhèn)蝺?yōu)劣的判斷多依靠老藥工的經(jīng)驗(yàn)來判斷，具有主觀性強(qiáng)、傳承難度大的缺點(diǎn)[21]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前電子眼、電子鼻、電子舌等新型仿生感官技術(shù)已逐步應(yīng)用于中藥飲片質(zhì)量控制方面，將傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別進(jìn)行了客觀化表達(dá)。
枳殼為蕓香科柑橘屬植物的未成熟果實(shí)，眾所周知，蕓香科柑橘屬植物所結(jié)果實(shí)的果皮中含有揮發(fā)油，大多數(shù)具有清香的氣味，且枳殼經(jīng)麩炒后氣味發(fā)生變化，轉(zhuǎn)變?yōu)?ldquo;略有焦香氣”。本研究基于Heracles NEO超快速氣相電子鼻建立了生、麩炒枳殼飲片氣味快速檢測(cè)方法，測(cè)定了生、麩炒枳殼飲片氣味指紋圖譜，指認(rèn)了11個(gè)氣味化學(xué)成分，其中甲基叔丁基醚和異戊醇為麩炒枳殼飲片中新增加成分；結(jié)合OPLS-DA模型中的VIP值及成分變化情況，推測(cè)D-檸檬烯、β-月桂烯和γ-松油烯為生、麩炒枳殼氣味差異標(biāo)志物。
枳殼經(jīng)麩炒后，其燥性得到緩和，偏于理氣健胃消食，生熟異治，更好地滿足臨床治療需求。揮發(fā)油是枳殼“寬中除脹”的主要活性成分，枳殼經(jīng)麩炒后，對(duì)胃腸道的刺激作用減弱，其含有的成分對(duì)胃排空、腸蠕動(dòng)具有明顯的促進(jìn)作用，能抑制胃腸平滑肌收縮[22-23]，還具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[20,24-27]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)麩炒的過程中輔料麥麩能與共炒的飲片發(fā)生化學(xué)變化[28]，存在相互吸附作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，枳殼經(jīng)麩炒后有成分的新增，已初步鑒定出的甲基叔丁基醚和異戊醇推測(cè)可能是麥麩與枳殼在高溫炒制過程中發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的新成分，也有可能是麥麩中的揮發(fā)性成分吸附至枳殼。枳殼和麥麩在炒制過程中揮發(fā)性成分的組成及含量變化是麩炒枳殼性味及功效發(fā)生變化的基礎(chǔ)，還需要進(jìn)一步深入研究麩炒過程中成分變化的規(guī)律，同時(shí)結(jié)合藥效學(xué)研究，闡明研究麩炒枳殼的炮制機(jī)理。
與傳統(tǒng)GC-MS聯(lián)用技術(shù)方法相比，超快速氣相電子鼻采用雙色譜柱同時(shí)進(jìn)樣分析，通過Kovats保留指數(shù)對(duì)氣味成分進(jìn)行定性分析，具有分析時(shí)間短、靈敏度高、樣品用量少、無需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理等優(yōu)點(diǎn)。但基于其檢測(cè)原理，儀器使用時(shí)對(duì)環(huán)境要求較高，使用過程中要保證環(huán)境的穩(wěn)定；且匹配數(shù)據(jù)庫(kù)AroChembase也具有一定局限性，國(guó)外在研發(fā)儀器時(shí)多是針對(duì)某一類物質(zhì)如烴類、醇類[30]，定性分析出來的氣味成分專屬性、特征性較弱，難以滿足氣味復(fù)雜的中藥的需求。但超快速電子鼻作為新興現(xiàn)代仿生技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)中藥飲片的快速檢測(cè)，有望應(yīng)用于中藥飲片生產(chǎn)過程的在線檢測(cè)，可極大促進(jìn)中藥飲片產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
本研究中生、麩炒枳殼鑒別出的氣味成分?jǐn)?shù)量有限，后續(xù)研究可結(jié)合GC-MS、HS-SPME-GC-MS等多種檢測(cè)手段，從定性定量角度更加全面分析枳殼麩炒前后各類成分變化情況，以期為研究枳殼麩炒機(jī)理及枳殼飲片生產(chǎn)質(zhì)量在線監(jiān)測(cè)提供參考。
來 源：中草藥雜志社
參考文獻(xiàn)：梅 茜，許金國(guó)，蘇聯(lián)麟，毛春芹，陸兔林，房 方．基于Heracles NEO超快速氣相電子鼻對(duì)枳殼麩炒前后氣味差異標(biāo)志物的快速識(shí)別研究 [J]. 中草藥, 2023, 54(16):5165-5171.
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